分析原理

 

在生物流體和血清中的許多復(fù)合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光，因此使用傳統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測(cè)的靈敏度就會(huì)嚴(yán)重下降。大部分背景熒光信號(hào)是短時(shí)存在的，因此將長(zhǎng)衰減壽命的標(biāo)記物與時(shí)間分辨熒光技術(shù)相結(jié)合，就可以使瞬時(shí)熒光干擾減到zui小化。

 

時(shí)間分辨熒光分析法（TRFIA）實(shí)際上是在熒光分析（FIA）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光的波長(zhǎng)與其激發(fā)波長(zhǎng)的巨大差異克服了普通紫外-可見(jiàn)分光分析法中雜色光的影響，同時(shí)，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上，激發(fā)光不能直接到達(dá)光電接受器，從而大幅度地提高了光學(xué)分析的靈敏度。但是，當(dāng)進(jìn)行超微量分析的時(shí)候，激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴(yán)重了。因此，解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。

 

解決雜散光影響的方法當(dāng)然是測(cè)量時(shí)沒(méi)有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。不過(guò)有非常少的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）的熒光壽命較長(zhǎng)，可達(dá)1～2ms，能夠滿足測(cè)量要求，因此而產(chǎn)生了時(shí)間分辨熒光分析法，即使用長(zhǎng)效熒光標(biāo)記物，在關(guān)閉激發(fā)光后再測(cè)定熒光強(qiáng)度的分析方法。

平時(shí)常用的稀土金屬主要是Eu（銪）和Tb（鋱），Eu熒光壽命1ms，在水中不穩(wěn)定，但加入增強(qiáng)劑后可以克服；Tb熒光壽命1.6ms，水中穩(wěn)定，但其熒光波長(zhǎng)短、散射嚴(yán)重、能量大易使組分分解，因此從測(cè)量方法學(xué)上看Tb很好，但不適合用于生物分析，故Euzui為常用。

 

信號(hào)原理

 

普通物質(zhì)熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，在選擇熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物時(shí)，必須考慮激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差，即Stokes位移的大小。如果Stokes位移小，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑭系元素的熒光光譜有較大的Stokes位移，zui大可達(dá)290nm，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜間不會(huì)相互重疊，加上其發(fā)射的光譜信號(hào)峰很窄，熒光壽命長(zhǎng)，銪的熒光壽命可達(dá)730us，檢測(cè)中只要在每個(gè)激發(fā)光脈沖過(guò)后采用延緩測(cè)量時(shí)間的方式，待短壽命的背景熒光衰變消失后，再打開(kāi)取樣門(mén)儀器記錄長(zhǎng)壽命銪鰲合物發(fā)射的特異性熒光，可以避免本底熒光干擾，提高檢測(cè)的精密度。

 

TRFIA的測(cè)量?jī)x器是時(shí)間分辨熒光計(jì)，由三大部分組成：光源：脈沖光源：氙燈（每秒閃爍1000次）；小型N2激光器；輸出脈沖波長(zhǎng)：337nm熒光信號(hào)獲取系統(tǒng)；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。

 

增強(qiáng)原理

 

解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯―ELFIA）是時(shí)間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過(guò)免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。由于這種復(fù)合物在水中的熒光強(qiáng)度非常弱，因此加入一種增強(qiáng)劑，使Eu從復(fù)合物上解離下來(lái)，自由Eu同增強(qiáng)劑中的另一種螫合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，信號(hào)增強(qiáng)了百萬(wàn)倍。因?yàn)檫@種分析方法使用了解離增強(qiáng)步驟，因此稱(chēng)為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?。這是目前在時(shí)間分辨熒光免疫分析中應(yīng)用zui多的一種分析系統(tǒng)。